Der Kanadier Richard Hannay besucht in London ein Musik‑Varieté, als plötzlich eine Schlägerei ausbricht und draussen Schüsse fallen. In der gedrängten Menge sucht eine nervöse Frau seine Nähe, stellt sich als Annabella Smith vor und bittet ihn eindringlich, sie mit in seine Wohnung zu nehmen, weil sie verfolgt werde.

In Hannays Appartement gesteht sie, Spionin zu sein: Eine ausländische Organisation wolle geheime Pläne für ein neuartiges, lautloses Flugzeugtriebwerk ausser Landes schmuggeln; der Chef der Gruppe, ein scheinbar unauffälliger Professor Jordan in Schottland, sei an der oberen Fingerglied eines kleinen Fingers zu erkennen. Noch in derselben Nacht wird Annabella in Hannays Wohnung erstochen, mit einem Messer im Rücken – auf einer Schottlandkarte, auf der sie nahe der «Alt‑Na‑Shellach»-Farm eine Stelle markiert hat.

Da die Polizei ihn für den Mörder hält und die wahren Täter vor dem Haus lauern, flieht Hannay im Mantel eines Milchmannes und besteigt den «Flying Scotsman» nach Norden. Im Zug wird er durch Zeitungsberichte über die «Wohnungsmord‑Affäre» zum Gejagten und entkommt einer Durchsuchung, indem er eine zufällig im Abteil sitzende Frau, Pamela, gegen ihren Willen küsst, sodass die Polizisten das Paar für harmlose Reisende halten. Pamela verrät ihn allerdings sofort darauf, und Hannay kann sich nur retten, indem er auf der Forth Bridge den Zug verlässt und ins schottische Hochland flieht. Er findet Unterschlupf bei einem misstrauischen Crofter, dessen junge Frau Mitleid mit ihm hat, ihn aber am nächsten Morgen vor nahenden Polizisten warnt und ihm heimlich den Mantel ihres Mannes mitgibt – in dessen Tasche eine Bibel steckt.

Hannay erreicht schliesslich das Landhaus von Professor Jordan, der ihn gastfreundlich empfängt, aber bald verrät, dass ihm ein Fingerglied fehlt: Er ist der gesuchte Spionagechef. In einer scheinbar höflichen Unterhaltung erfährt Hannay, dass «die 39 Stufen» eine Organisation von Agenten sind, die die Motorpläne ausser Landes bringen wollen – und dass Annabella deshalb sterben musste. Jordan versucht, Hannay zum Schweigen zu bringen und schiesst auf ihn; nur die im Mantel steckende Hymnenbuch‑Bibel des Crofters rettet ihm das Leben, indem sie die Kugel abfängt. Als Hannay später im Polizeirevier die Wahrheit erzählt, stellt sich heraus, dass die örtlichen Beamten Jordan persönlich kennen und ihm glauben – bis sie sich ebenfalls als Teil der Verschwörung entpuppen, sodass Hannay erneut fliehen muss.

Auf der Landstrasse gerät er an zwei Männer, die sich als Polizisten ausgeben und ihn mitsamt der zufällig vorbeikommenden Pamela im Auto mitnehmen. Unterwegs erkennt Hannay, dass sie Agenten Jordans sind; als eine Schafherde den Weg blockiert, versuchen die Männer, zu Fuss den Weg freizuräumen, und lassen Hannay und Pamela, aneinander gefesselt, im Wagen zurück. Die beiden Fliehenden irren über das Moor, gezwungen, körperlich ständig in Kontakt zu bleiben; der anfängliche Hass Pamelas – die immer noch glaubt, mit einem Mörder aneinandergekettet zu sein – wandelt sich, als sie mitanhört, wie Hannay in einer Herberge seine Geschichte glaubwürdig schildert. Im Schutz der Nacht gelingt ihnen die Flucht, und als Pamela wenig später zufällig erfährt, dass die Polizei inzwischen Zweifel an Hannays Schuld hat, entscheidet sie sich, ihm zu vertrauen.

In London gehen sie gemeinsam in das Musiktheater zurück, in dem alles begonnen hat. Auf der Bühne tritt erneut der Gedächtniskünstler «Mr. Memory» auf, der komplexe Fakten aus dem Stegreif deklamiert; Hannay erkennt, dass die geheimen Flugzeugpläne nicht auf Papier, sondern im Gedächtnis dieses Mannes gespeichert sind – Mr. Memory ist das lebende MacGuffin. Als Hannay laut nach den «39 Stufen» fragt, antwortet der Künstler reflexhaft und wird im selben Moment von einem Schuss getroffen, der aus der Richtung Jordans stammt. Sterbend bestätigt Mr. Memory, dass er bezahlt wurde, die Pläne auswendig zu lernen, und wiederholt Teile der Konstruktion – genügend Beweis, um Hannays Unschuld zu belegen, Jordan zu entlarven und die Verschwörung zu zerschlagen, während Hannay und Pamela, nun frei und sichtbar ein Paar, Hand in Hand im Off stehen.